Sete coisas para evitar no laboratório de cromatografia

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Dez 2018

Nos dias em que minha empresa desenvolvia software cromatográfico, eu gastava minha parte do tempo no telefone com chamadas de suporte técnico.

Tem algum problema com o seu sistema de CL? Talvez aplicar um pouco das regras "Não faça isso" podem ajudar.

Nos dias em que minha empresa desenvolvia software cromatográfico, eu gastava minha parte do tempo no telefone com chamadas de suporte técnico. Algumas das chamadas foram algo assim:

JWD: Suporte técnico de cromatografia líquida (CL), em que posso ajudar?

Cliente: Eu tenho um problema com o travamento do seu software.

JWD: Oh, isso é terrível. Houve alguma coisa em particular que desencadeou isso?

Cliente: Claro. Toda vez que pressiono CTRL-ALT -; -! o software falha.

JWD: Oh, isso não é bom. Nós também não gostamos de travamentos. Vou passar isso para nossa equipe de programação.

E então, como brincadeira, nós tínhamos uma pasta de arquivos com essas reclamações rotuladas como soluções eram simples, chamamos de as "Regras - Não faça isso!"

Como ensino aulas de cromatografia líquida (CL) em todo o mundo, nunca deixo de me divertir com algumas das práticas criativas que alguns dos alunos inventaram que podem causar problemas com o hardware ou método da CL. Alguns destes devem ser classificados como Regras para cromatográficos. Eu gostaria de compartilhar sete regras para CL. Considere-os como precauções que, se evitadas, tornarão sua vida no laboratório uma experiência muito mais feliz. Estes são apresentados em nenhuma ordem particular ou ranking.



# 1: Não faça pH orgânico

Existem três maneiras de preparar um buffer e ajustar seu pH: o caminho certo, o caminho mais fácil e o caminho errado. Digamos que queremos preparar 1 L de um tampão acetato de pH 4,0 a uma concentração de 20 mM. O modo certo de fazer esse buffer seria pesar as quantidades apropriadas de ácido acético e acetato de sódio de acordo com as instruções de uma das calculadoras de buffer on-line (como http://www.zirchrom.com/Buffer.asp) e dilua-os para 1 litro em um balão volumétrico. Alternativamente, você poderia fazer 20 mM soluções de ácido acético e acetato de sódio e misturá-los juntos até que o pH medido foi de 4,0. Qualquer um desses métodos produziria o que você pretendia, aproximadamente 1 L de um tampão de acetato de pH 4,0 a 20 mM. A maneira fácil de fazer o mesmo tampão seria preparar 1 L de acetato de sódio 20 mM e, em seguida, titular o pH a 4,0 usando ácido acético concentrado. Isto produziria um pouco mais de 1 L de tampão acetato a pH 4,0, mas a concentração não seria 20 mM, porque o ácido acético concentrado foi usado para a titulação. Isso importará? As separações de fase reversa não são muito sensíveis à concentração do buffer, desde que esteja acima de um limite mínimo (5 a 10 mM na maioria dos casos), portanto, é improvável que o modo fácil daria resultados cromatográficos diferentes do que o caminho certo para preparar este amortecedor. No entanto, a troca iônica, a cromatografia por interação hidrofílica (HILIC), o modo misto e outros modos de separação nos quais as interações iônicas são importantes podem ser sensíveis à concentração do tampão. Portanto, nesses casos, pode haver uma diferença observável na separação quando as duas técnicas diferentes de preparação de tampão são usadas. Seja qual for a maneira que você escolher para preparar o buffer, essa técnica deve ser anotada no documento do método CL para que outros possam obter os mesmos resultados.

O modo errado de fazer parte do tampão é ajustar o pH da solução após o tampão aquoso ser combinado com o componente orgânico da fase móvel, tal como metanol ou acetonitrilo. Quando solventes orgânicos estão presentes, os medidores de pH apresentam resultados diferentes dos obtidos em soluções aquosas. Além disso, essas leituras de pH podem variar com a temperatura do laboratório de maneiras que não são adequadamente compensadas pelo hardware e software do medidor de pH. O tampão resultante pode dar resultados cromatográficos diferentes do que o tampão preparado nas duas primeiras maneiras. Lembro-me de um projeto de consultoria que tive uma vez em que o método funcionava no verão, mas não no inverno. O laboratório estava em uma instalação de produção mal aquecida, o pH do tampão foi ajustado depois que o componente orgânico foi adicionado, e a diferença no pH efetivo foi suficiente para fazer com que o método falhasse no inverno.

Ao reportar a composição tampão e o pH em CL, é habitual referir o pH da porção aquosa do tampão e ignorar o que acontece quando o solvente orgânico é adicionado. Sim, o pH aparente mudará com o solvente orgânico presente, mas mudará da mesma maneira todas as vezes. A Regra # 1 nos lembra de nunca ajustar o pH do buffer quando o solvente orgânico estiver presente



# 2: não use a mesma coluna para vários métodos

Quando você tem dois métodos de CL que exigem a mesma descrição de coluna, é melhor não usar a mesma coluna individual para os dois métodos. Uma abordagem melhor é comprar duas colunas separadas e usar uma para cada método. Embora pareça não haver mal algum em usar uma coluna para dois métodos diferentes, mais cedo ou mais tarde você encontrará casos em que os picos não importantes de um método, como os de impurezas, excipientes ou materiais com eluição tardia, causarão problemas no segundo método. Isto pode ser mais evidente quando um método é para a determinação de grandes concentrações de analito, tal como uma determinação de uniformidade de conteúdo, e o segundo método é para degradantes menores ou impurezas em outro produto. No entanto, os problemas às vezes ocorrem com dois métodos diferentes para o mesmo produto, se uma coluna for usada para ambos. Ao dedicar uma coluna a cada método, um benefício adicional é que o orçamento da coluna anual pode ser menor. A Regra # 2 nos diz para usar uma coluna separada para cada método de CL.



# 3: não desenvolver um novo método em uma coluna usada

Vamos enfrentá-lo, as colunas são caras, e muitos de nós não têm o luxo de colocar uma nova coluna no sistema de CL cada vez que queremos exibi-lo como uma coluna candidata em potencial para um método em desenvolvimento. Tentar usar uma coluna pouco usada durante os experimentos de seleção de colunas não deve ser um problema. No entanto, depois de selecionar uma determinada marca e modelo de coluna como um candidato sério para o desenvolvimento de métodos, coloque uma coluna não utilizada na CL para o trabalho de desenvolvimento de método. Muitas vezes, uma coluna que foi usada para outra finalidade ou método pode não ter mais as mesmas propriedades químicas de uma nova coluna de substituição (veja a Regra # 4 abaixo). Imagine a frustração se você passar algumas semanas desenvolvendo um método satisfatório, apenas para descobrir que não funcionou com uma nova coluna. Apenas não vale a pena o risco. A Regra # 3 nos ajudará a evitar mudanças indesejadas no método no final do processo de desenvolvimento do método.



# 4: Não use uma coluna de emparelhamento de íons para um método de emparelhamento não-iônico

Este cuidado anda de mãos dadas com as Regras # 2 e # 3. Os reagentes de emparelhamento de iões, especialmente os mais hidrófobos, como os sulfonatos de cadeia mais longa, nunca são completamente removidos da coluna durante os procedimentos de limpeza ou regeneração da coluna. Por exemplo, num estudo (1), apenas cerca de metade do lauril sulfato foi removido por lavagem de uma coluna C18 com ~ 700 volumes de coluna (1 L) de tampão 20:80 metanol-fosfato. Os autores não foram capazes de remover todo o reagente de pareamento de íons, mesmo com 100% de metanol ou isopropanol. Os reagentes de emparelhamento de iões de cadeia mais curta são removidos mais facilmente, mas é prudente assumir que, uma vez que um reagente de emparelhamento de iões seja colocado na coluna, nunca será completamente removido. Os vestígios de reagentes remanescentes do histórico da coluna anterior podem alterar a química da coluna o suficiente para que a coluna nunca seja equivalente a uma nova coluna. Em tais casos, as Regras # 2 e # 3 se aplicam. A Regra # 4 nos lembra de que é seguro não usar uma coluna que tenha experimentado reagentes de pareamento de íons para qualquer método de emparelhamento não-iônico.



# 5: não assuma que todas as colunas C18 são equivalentes

Ao mesmo tempo, assumimos que todas as colunas C18 deram separações equivalentes. De fato, a United States Pharmacopoeia (USP) tem um esquema de classificação "L" que descreve as colunas CL de acordo com sua química. Uma coluna L-1 é qualquer coluna C18 ligada a sílica ou cerâmica, com ou sem tampa de extremidade. Cromatógrafos experientes sabem que este não é o caso, mas pode não ser óbvio para os recém-chegados. Um exemplo disso é visto quando comparamos os cromatogramas da Figura 1. A maioria dos trabalhadores concorda que a coluna do fabricante A fornece uma separação equivalente à do fabricante B, embora os tempos de retenção não sejam exatamente os mesmos. Por outro lado, o cromatograma gerado na coluna do fabricante C é distintamente diferente das outras duas colunas. No entanto, todas as três colunas são colunas C18. A Regra # 5 nos diz para ter cuidado ao usar qualquer coluna diferente da marca e modelo específicos recomendados para um método específico.
não assuma que todas as colunas C18 são equivalentes
Figura 1: Diferenças na seletividade entre colunas C18 de três fabricantes. Baseado em dados da referência 2.



# 6: Não encha o reservatório de tampão

Os tampões usados ​​nas separações de CL, como acetato e fosfato, podem criar um ambiente atraente para o crescimento microbiano. Em nosso laboratório, uma vez testamos buffers para ver quanto tempo durariam até que tivessem uma população significativa de microrganismos. Vários frascos de proteção foram colocados em uma janela e monitorados ao longo do tempo. Nossas conclusões foram de que provavelmente poderíamos usar os tampões por duas semanas antes de termos que nos preocupar, então tomamos a abordagem conservadora e definimos a data de expiração para todos os tampões uma semana depois que eles foram formulados. Eu sei que muitos trabalhadores são capazes de usar buffers por mais de duas semanas, mas isso depende do buffer, do pH e do ambiente geral do laboratório. No entanto, não importa quais precauções você tome, os erros eventualmente começarão a crescer no reservatório de buffer. Se você não substituir o reservatório por um limpo a cada vez que adicionar um tampão, estará apenas inoculando o novo lote com os organismos crescendo nos poucos mililitros remanescentes do anterior. Este é um problema especialmente sério com CL de ultra-alta pressão (UHPLC), porque as colunas usam frits de porosidade de 0,2 μm, que são pequenos o suficiente para ficarem bloqueados por bactérias. Uma prática melhor do que completar o reservatório é substituir o reservatório por um limpo a cada vez que um novo buffer é preparado. A Regra # 6 nos lembra de não contaminar inadvertidamente reagentes recém-preparados.



# 7: não pique moedas que custam dólares

Fico impressionado com a frequência com que ignoramos as realidades econômicas no laboratório. A coisa mais cara do laboratório é você - se você não acredita, pergunte ao seu chefe! Isso significa que precisamos ser prudentes ao tentar economizar dinheiro. Alguns exemplos sobre os extremos do custo ilustrarão esse ponto.

Primeiro, o que você faz com um filtro de entrada de solvente que suspeita estar bloqueado? É uma prática comum para sonicar estes frits por alguns minutos como uma tentativa de limpá-los. Isso é marginalmente bem-sucedido, na melhor das hipóteses, e essa limpeza durará apenas uma fração do tempo que um novo filtro durará. Conservadoramente, um funcionário de laboratório custa US $ 100.000 ou mais por ano (totalmente sobrecarregado com salário, benefícios e assim por diante), o que se traduz em ~ US $ 50 / h. Quanto tempo você pode justificar ao tentar limpar um filtro de US $ 15 antes de gastar mais em mão-de-obra do que em uma peça nova?

Um segundo exemplo é o uso de medidas heróicas para prolongar a vida útil da coluna. Acabei de ler um tópico em um dos grupos de discussão on-line de cromatografia, onde muito conselho estava sendo dado nessa área. Isso incluiu lavar a coluna com solventes fortes, como diclorometano, ou solubizadores de proteína. Essas práticas quase nunca retornam a coluna a novos níveis de desempenho, e podem levar muito tempo ao passar por uma série de solventes mutuamente miscíveis e voltar à fase móvel.

É fácil passar uma ou duas horas nessa tarefa com resultados marginais.

Eu já disse muitas vezes antes em "Regras de CL" que, se você obtiver de 500 a 600 amostras em uma coluna de US $ 500 a US $ 600, o custo é de apenas US $ 1 / amostra. Nesse ponto, a coluna não lhe deve nada. Quase três quartos dos usuários obtêm pelo menos 500 amostras em uma coluna antes de falhar, e quase a metade consegue processar mais de 1000 amostras. É importante limpar a coluna após cada lote de amostras, e talvez até mesmo invertê-la ocasionalmente, mas qualquer coisa além disso pode não fazer sentido. A Regra # 7 nos diz que devemos considerar o custo real de tentar reformar uma parte do CL em vez de substituí-lo por uma nova peça.


Conclusão

Nós analisamos sete práticas ruins que estão vivas e bem em muitos laboratórios. Vamos transformá-los em suas cabeças e transformá-los em práticas recomendadas que façam sentido e ajudem a melhorar a produtividade no laboratório.

Fonte: John W. Dolan

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